群益证券小奕说药关键质量属性(CQA)评估(3）：氧化

引言

一般来说，CQA与原料药、辅料、中间体(中间过程样品)和药品有关。由目标产品质量概况和/或早期已有知识中，可以初步获得药品潜在CQA（pCQA），从而指导产品及工艺开发。在选择处方和生产工艺时，随着对产品知识和工艺的不断了解，可以调整这些初步确立的潜在CQA。在后续的评价过程中，可运用质量风险管理，再对潜在CQA 进行优先排序。通过反复的质量风险管理过程，以及评价参数变化对药品质量影响程度的实验，可以最终确定相关的CQA。

蛋白药物在生产、储存和使用过程中容易发生氧化修饰，氧化修饰会改变蛋白药物的结构和性质，进而影响其疗效和安全性。氧化会发生在多种氨基酸残基上，最容易发生氧化修饰的是甲硫氨酸（Met）, 甲硫氨酸又称蛋氨酸（Met），其与半胱氨酸是仅有的两种天然含硫氨基酸，硫原子在催化、金属结合、氧化还原调节以及其他翻译后修饰中起到十分关键作用。抗体甲硫氨酸氧化是指抗体蛋白中的甲硫氨酸残基发生了氧化，是上百种翻译后修饰类型中的一种。氧化风险评估从安全性、有效性两方面进行评估，并进行风险评分。

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图1. 甲硫氨酸氧化对抗体生物学功能的影响

1.安全性评估

Torosantucci等人在其综述[1]中阐明经H2O2、UV光照或者金属离子的氧化后的IgG1和IgG2，会有聚体产生，靶向结合和生物学活性丢失，以及免疫原性增高的现象；而经t-BHP氧化后的单克隆抗体，在初级结构中可知，甲硫氨酸易被氧化；高级结构中可观察到聚体或片段的产生；生物学功能方面发现其会降低Protein A的亲和力，并无免疫原性的相关报道。

2.有效性评估

抗体或具有典型的抗体结构的蛋白类药物在常见的甲硫氨酸氧化位点包含重链的M252、M428、M358，其中M252位于CH2区，M428位于CH3区，M252和M428均位于CH2-CH3区域，也是Fc-Rn的结合位点；M358位于CH3-CH3区域，远离FcRn结合位点，一般认为该位点氧化对FcRn的结合影响较小；Gao等人的研究结果证实了M252和M428位点氧化均降低了Fc与FcRn的结合力，而M358的氧化对其结合力无影响[2]。

此外，仍有文献报道Fc端甲硫氨酸的三个氧化位点（Met257、Met363和Met433）中的一个或多个干扰了mAb1与FcRn的结合，以及C1q的结合，从而影响CDC的活性，CDC的活性随着氧化程度的升高而降低[3]。Wang进一步报道了，在IgG1抗体中，Fc-Rn的结合力随着甲硫氨酸氧化（H2O2强制氧化）程度的升高而降低，并在FcRn人源化小鼠研究中发现Met 252氧化40%左右时，与未氧化样品相比，其血清半衰期并无明显变化，而Met 252氧化80%后，其血清循环半衰期减少了4倍以上；在长期条件（2-8℃）保存3年的抗体，对其氧化组分进行收集，得到的氧化样品（Met 252氧化43.2%），其PK值减少了28%[4]。经t-BHP氧化的单克隆抗体，并没有引起聚体的发生，Fc与FcRn结合力明显降低，ADCC活性降到80%，活性下降较小[5]。

3.风险评分

结合文献报道，对安全性和有效性进行评估，依据既有知识并采用PQAA评估工具（PQAA评估工具介绍，详见“小奕说药丨关键质量属性（CQA）评估（1）：蛋白质聚集”），对甲硫氨酸氧化的最终风险评分为3分（详见下表）。

整体来说，氧化对非免疫安全性无显著影响，对免疫原性、药代动力学和效价有轻微影响，因此氧化属于蛋白质药物的非关键质量属性。

表1. 氧化严重性评分（使用PQAA评估工具）

参考文献

[1] Torosantucci R , C Schöneich, Jiskoot W . Oxidation of Therapeutic Proteins and Peptides: Structural and Biological Consequences[J]. Pharmaceutical Research, 2013, 31(3).

[2] Effect of Individual Fc Methionine Oxidation on FcRn Binding: Met252 Oxidation Impairs FcRn Binding More Profoundly than Met428 Oxidation[J]. J Pharm, 2015, 104(2).

[3] Jingjie, Mo, Qingrong, et al. Understanding the Impact of Methionine Oxidation on the Biological Functions of IgG1 Antibodies Using Hydrogen/ Deuterium Exchange Mass Spectrometry[J]. Anal Chem, 2016.

[4] Wang W , Vlasak J , Li Y , et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies[J]. Molecular Immunology, 2011, 48(6-7):860-866.

[5] Shah D D , Jingming Z , Ming-Ching H , et al. Effect of Peroxide- Versus Alkoxyl-Induced Chemical Oxidation on the Structure, Stability, Aggregation, and Function of a Therapeutic Monoclonal Antibody[J]. Journal of pharmaceutical sciences, 2019, 2018年107卷11期:2789-2803页.